Nato Giovanni Battista Moroni dall'architetto Andrea Moroni, il pittore era chiamato anche Giambattista Moroni. Lavorando nello stile manierista italiano, Moroni divenne noto come un un ritrattista tra i migliori del XVI secolo, ma famoso anche per i suoi dipinti religiosi.
Si formò presso il pittore religioso Alessandro Bonvicino, di Brescia, chiamato il Moretto da Brescia (1498-1554). Potrebbe aver studiato anche con Tiziano (1485-1576). Moroni incontrò Tiziano durante il periodo trascorso a Trento, dove realizzava i ritratti che Tiziano non poteva realizzare per le troppe commissioni. Anche se non raggiunse la grandezza di Tiziano, i suoi ritratti erano di gran lunga superiori alle sue opere di carattere religioso. Il suo stile ritrattistico avrebbe influenzato l'opera del pittore bergamasco Fra Galgario (1655-1743) e il famoso veneziano Pietro Longhi (1701-1785). Si tratta di opere molto personalizzate, che sembrano contenere la vera essenza del soggetto, in una luce sofisticata e venerabile.
Inizialmente lavorò ad Albino, nella provincia di Bergamo. Alcune delle sue opere religiose furono realizzate per la cattedrale di Verona, per sant'Alessandro della Croce e per la chiesa di Gorlago, per cui lasciò un'opera incompleta. Alcuni dei suoi ritratti più noti si trovano alla Galleria degli Uffizi, tra questi ricordiamo il Ritratto del cavaliere Pietro Secco Suardo, il Ritratto di un dotto e il Ritratto del poeta Giovanni Antonio Pantera. Altre opere si trovano alla National Gallery di Londra, tra cui Il sarto, ma i suoi quadri sono sparsi nei musei di tutto il mondo.