Nella rivalità con Firenze, i pittori senesi, come Beccafumi, si orientarono verso la presenza mistica, mentre i fiorentini si concentrarono sul naturalismo. Beccafumi era considerato uno degli ultimi ad abbracciare completamente la scuola senese. Nato Giacomo di Pace, prese il cognome del proprietario terriero e padrone del padre, Lorenzo Beccafumi. Dopo un apprendistato, andò a Roma, per conoscere il lavoro di Michelangelo (1475-1564) e Raffaello (1483-1520).
Beccafumi si diresse anche a Firenze, dove conobbe il geniale uso del chiaroscuro di Leonardo (1452-1519). Beccafumi fuse le influenze dei maestri italiani nell'elegante ed emozionante stile senese, con l'astrazione manieristica del tempo.
Tra i suoi primi lavori a Siena, quello in collaborazione con il Sodoma (1477-1549), per la facciata di Palazzo Borghese, nel 1512. Nel 1517, condusse le decorazioni della chiesa di San Bernardino, e realizzò varie opere religiose per questa e altre chiese senesi. Tra queste opere: Comunione miracolosa di santa Caterina da Siena, Santa Caterina da Siena riceve le stimmate, entrambi al J. Paul Getty Museum di Los Angeles, dove si trova anche il disegno di studio per la figura di Abramo, del 1547.
Agli Uffizi troviamo i suoi Sacra Famiglia con San Giovannino, del 1518/20 e La fuga di Clelia. Rimane più noto il suo lavoro per le decorazioni del pavimento del duomo di Siena. Questo incredibile progetto impegnò gli artisti per più di 150 anni, e Beccafumi vi lavorò dal 1517 al 1544. Le sue incisioni nel marmo bianco raffiguravano storie dalla Bibbia, tra cui Acab, Elia, Melchisedech, Abramo e Mosè.
Il principe Doria lo chiamò a Genova, per dipingere l'affresco con episodi della vita di Medea e Giasone, ora perduto. Rientrò a Siena poco dopo, e lavorò di nuovo alla cattedrale. Realizzò anche un arco trionfale per l'ingresso in città dell'imperatore Carlo V (1500-1558), insieme a un cavallo meccanico per i festeggiamenti.
L'opera di Beccafumi presenta figure allungate, come quelle dei manieristi, e utilizza il contrapposto, fatto risorgere da Michelangelo e Leonardo nel Rinascimento. Usava colori tenui, a volte di tono primario, e composizioni fluide, che si differenziavano dai contorni geometrici allora di moda. Lo notiamo in maniera evidente nella sua opera agli Uffizi, la Sacra Famiglia con San Giovannino. La sua arte può provocare sentimenti più contrastanti ed emozionanti nelle composizioni che evocano rapimenti mistici: un drastico culmine dello stile senese.