Nonostante abbia lavorato a Firenze, Ambrogio Lorenzetti è noto tra i pittori di scuola senese. Questa scuola di pittura, di Siena, aveva uno stile elegante, riconosciuto al tempo anche dai rivali, persino dai pittori fiorentini tra il XIII e il XV secolo.
L'opera di Lorenzetti sopravvive con un dipinto del 1328 che contiene la prima documentazione dell'esistenza della clessidra. Egli contribuì anche a un'opera di rilevanza storica, Allegoria ed effetti del Buono e del Cattivo Governo, un'enciclopedia pittorica che presenta una campagna idealizzata e un borgo medievale. Quest'opera presenta uno stile simile a quello degli affreschi realizzati da Lorenzetti sulle pareti della Sala dei Nove, o Sala della Pace, nel Palazzo Pubblico di Siena. Sono opere importanti per la ricostruzione della storia di Siena, e mostrano un artista politicamente scaltro e un bravo osservatore morale.
Questi affreschi, risalenti al 1337-1339, sono rappresentazioni mondane di figure allegoriche della virtù che guida il governo della repubblica. Ai lati degli Effetti del Buon Governo in Città e in campagna, ci sono altri tre affreschi, meno conservati, Allegoria del Buon Governo, Allegoria del Cattivo Governo e Effetti del Cattivo Governo in Città e in campagna. Sono opere complesse, panoramiche che svelano l'influsso gotico di altri pittori senesi, come Simone Martini (1284-1344).
Tuttavia, l'opera di Lorenzetti mostra un approccio più naturalistico rispetto a quello di Martini o di un altro artista senese, Duccio. L'artista ricevette anche l'influsso di suo fratello, il pittore Pietro Lorenzetti (1280-1348). I fratelli Lorenzetti sono considerati i responsabili dell'introduzione di questo approccio naturalistico nella scuola senese. Attraverso suo fratello, l'influenza di Ambrogio può essere ritrovata anche in quella di Giotto.
Pochissime opere di Lorenzetti sono giunte fino a noi e il suo primo lavoro conosciuto è la Madonna con Bambino, eseguita nel 1319. Le altre sue opere, oltre agli affreschi nella Sala dei Nove, comprendono un affresco a San Francesco, dal titolo L'investitura di san Ludovico di Tolosa (1329), una pala d'altare in San Procolo del 1332, intitolata Madonna con Bambino tra i santi Nicola e Procolo, un altro affresco a San Francesco, il Martirio dei Francescani (1336), e una pala d'altare di Santa Petronilla, commissionatagli per l'altare di San Crescenzo nella cattedrale di Siena, nel 1342.
Si dice spesso che lo stile dell'opera di Lorenzetti abbia anticipato il Rinascimento italiano. Al tempo, un'epidemia di peste bubbonica devastò la regione e si presume che entrambi i fratelli Lorenzetti siano morti per questa malattia.